抽象的

细胞壁完整性通路在细胞壁胁迫（CWS）下被激活。曲霉的防御系统利用三种转录因子——RlmA、MsnA 和 CrzA——它们也促进对各种非生物胁迫的适应，并涉及胞质渗透调节物质组成和膜脂谱的改变。然而，它们在适应细胞壁胁迫中的作用尚不清楚。在黑曲霉中，刚果红和钙荧光白诱导的细胞壁胁迫导致顶端生长明显停止，并伴有菌丝球状膨胀以及细胞壁中几丁质和葡聚糖含量的增加。渗透调节物质主要由低水平的甘油和甘露醇组成，在细胞壁胁迫下甘油水平降低。细胞壁胁迫后，膜脂和储存脂的组成和含量均未发生变化；然而，由于亚麻酸比例升高，磷脂的不饱和度增加，这可能增强了膜的流动性。膜脂和渗透调节物质的这些微小重排并不能证实它们参与了刚果红和钙荧光白诱导的对细胞壁损伤的适应，这与之前基于细胞壁完整性途径研究的假设相反。

关键词：

细胞壁应激；刚果红；钙荧光白；磷脂酸；多元醇；几丁质；葡聚糖

1. 引言

细胞壁（CW）维持细胞的形状和完整性，是细胞包膜的一部分，与质膜一起构成抵御各种不利环境条件的第一道防线[ 1 ]。真菌细胞壁是一种动态的多功能结构，负责生物和非生物相互作用。它能抵抗渗透压和机械应力，并维持细胞形态[ 2 ]。此外，它还是多种酶的结合位点，并作为表面蛋白和糖蛋白的基质，这些蛋白和糖蛋白参与识别、黏附和有性生殖[ 3 ]。细胞壁的重塑贯穿整个生命周期，并响应胁迫、营养缺乏、损伤以及互利共生或寄生关系的建立[ 2 ]。

与酵母不同，丝状真菌的细胞壁由多种葡聚糖（β-1,3-葡聚糖、β-1,3/β-1,4-葡聚糖、β-1,6-葡聚糖和α-1,3-葡聚糖）、几丁质和壳聚糖、甘露聚糖和/或半乳甘露聚糖以及糖蛋白组成[ 4 ]。葡聚糖和几丁质由与其相关的合成酶在质膜上合成，形成线性聚合物。真菌细胞壁的主要成分是β-1,3-葡聚糖，其重量占细胞壁的30-80%。β-1,3-葡聚糖不形成微纤维；它是一种具有β-1,6分支的支链聚合物，呈三螺旋结构，并作为蛋白质附着的基质[ 5 ]。然而，线性α-1,3-葡聚糖能够形成微纤维[ 6 ]。几丁质是由N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1,4糖苷键形成的线性均聚物。真菌细胞壁中几丁质的比例从2%（酵母）到30%（丝状真菌）不等。细胞壁区域内反平行的几丁质链之间形成大量的氢键，从而形成微纤维或棒状结构[ 5 ]。几丁质的刚性源于其线性反平行的链结构，使其成为自然界中最强的生物聚合物之一。几丁质以微纤维的形式定位于细胞壁内层，并与柔性β-1,3-葡聚糖链共价结合。糖蛋白在内质网和高尔基体中合成，并通过分泌进入细胞壁区域。此外，在交联转糖苷酶和糖苷水解酶的作用下，葡聚糖、几丁质和糖蛋白共价结合，形成细胞壁的三维结构。刚性部分与柔性区域交错排列似乎是真菌细胞壁的一个共同特征，尽管其化学组成可能有所不同。例如，在烟曲霉中，几丁质与α-1,3-葡聚糖紧密堆积，形成由动态β-1,3-葡聚糖连接的刚性片段[ 7 ]。其他多糖（半乳甘露聚糖、半乳糖胺半乳聚糖和β-1,3-1,4-葡聚糖）通过转糖苷酶与几丁质-葡聚糖复合物共价结合[ 8 ]。

在真菌的生命周期中，细胞壁应激（CWS）在体内发生，是对性信息素的响应，性信息素会诱导细胞壁成分的重组。CWS也会在多种应激条件下出现，例如氧化应激、极端pH值、DNA损伤剂、热休克和低渗休克[ 3 ]。此外，一些化学物质可以干扰细胞壁主要多糖（葡聚糖和几丁质）的合成或组装，从而引发CWS。为了在体外诱导CWS，可以使用偶氮染料，例如刚果红（CR）和钙荧光白（CFW），溶菌酶（溶菌酶），杀菌性1,3-β-D-葡聚糖合酶抑制剂（环状脂肽棘白菌素、酸性萜类化合物恩富马芬菌素、糖脂类化合物帕普拉菌素），或几丁质合酶抑制剂（尼克霉素、多氧霉素）[ 9 , 10 ]。这些试剂会削弱细胞壁，导致真菌细胞裂解。

CFW被认为能更特异性地结合几丁质，而CR主要结合α-1,3-和β-1,3-葡聚糖[ 11 , 12 ]。向活跃生长的细胞中添加CR或CFW会导致形态变化，包括酵母中母细胞和子细胞分离不完全，以及菌丝真菌中菌丝顶端的肿胀和裂解。这些偶氮染料被认为能抑制新合成的几丁质、β-1,3-和β-1,6-葡聚糖链之间的键合，从而破坏细胞壁的二级结构，导致其弱化并最终裂解。然而，这些偶氮染料的确切作用机制仍不甚明了。值得注意的是，CR的作用不仅限于细胞壁，它还会影响烟曲霉的初级和次级代谢，表明其具有多效性[ 12 ]。

细胞壁完整性（CWI）通路在细胞壁水分流失（CWS）后被激活，导致主要细胞壁多糖——几丁质和α-葡聚糖的合成增强[ 13 ]。这些发现与观察到的gfaA转录上调相一致，gfaA编码谷氨酰胺：果糖-6-磷酸酰胺转移酶，该酶催化黑曲霉（A. niger）中CFW诱导的CWS后几丁质合成的第一步也是限速步骤[ 9 ]。在构巢曲霉（ A. nidulans）中，中型CWI传感器蛋白MtlA高度O-糖基化并定位于细胞表面[ 14 ]。MtlA的缺失会增加对CWI抑制剂的敏感性，并降低细胞壁α-葡聚糖和几丁质的含量。 CWI通路是一个多步骤磷酸化级联反应，涉及通过丝裂原活化蛋白激酶激酶（MAP2K）和转录因子RlmA诱导GTP酶RhoB和RhoD的表达。然而，黑曲霉复杂的防御系统在CWS条件下至少利用了三种转录因子——RlmA、MsnA和CrzA[ 15 ]。CWI通路在形态发生、毒力和抗真菌药物敏感性中起着至关重要的作用[ 16 ]。然而，正如在酵母中观察到的那样，曲霉中还有两条额外的通用应激反应通​​路参与了对CWS的响应。这两条通路包括一条类似于酵母中Msn2p/Msn4p系统的转录因子介导通路（由曲霉中的MsnA同源物介导），以及分别由Crz1p和CrzA介导的钙/钙调磷酸酶通路[ 17 ]。这些通路促进细胞适应多种非生物胁迫，例如热、冷和渗透胁迫，这些胁迫涉及胞质渗透调节物质组成和膜脂谱的改变。值得注意的是，激活CWI信号通路的转录因子RlmA也影响脂质代谢，某些MAP激酶不仅参与细胞对冷水汽沉积（CWS）的适应，也参与对热和渗透胁迫的适应[ 17 ]。此外，膜不稳定化合物，例如十二烷基硫酸钠，已被证明可以诱导CWS。研究还揭示了响应CWS、渗透胁迫、氧化胁迫和热胁迫的信号通路之间的相互作用[ 18 , 19 ]。这些发现引发了关于渗透调节物质和膜脂在响应CWS中的作用的重要问题。

真菌在生物技术领域被广泛用于生产酶、有机酸和生物活性物质[ 20 ]。这些产物大多通过细胞壁分泌。因此，研究表明，负责合成某些细胞壁多糖的基因发生突变可以提高生产真菌中有机酸和酶的产量。此外，曲霉属真菌中的α-1,3-葡聚糖作为一种粘附因子，参与菌粒的形成[ 21 ]。

丝状真菌通过调控细胞表面多糖的展示，控制其宏观形态，例如形成菌球和松散菌落（絮状物），进而影响其生产力。此外，抑制细胞壁完整性（CWI）信号传导是防治动植物病原体的有效策略。真菌细胞壁是开发新型抗真菌药物的理想靶点，因为其组成与细菌或植物细胞壁以及动物细胞膜的组成存在根本差异[ 22 ]。此外，酵母和丝状真菌细胞壁在组成和结构上的差异可能具有潜在的益处。真菌对细胞壁完整性（CR）的耐受性已被用作不同生态位（例如昆虫病原体、植物病原体、腐生菌和真菌寄生菌）的有效指标[ 23 ]。因此，研究真菌对细胞壁完整性的响应具有重要的基础研究和实际应用价值。

本研究旨在调查在 CR 和 CFW 诱导的 CWS 条件下，黑曲霉CW 的膜脂、渗透调节物质和碱性多糖的组成。

2. 结果

2.1.偶氮染料对黑曲霉菌丝形态的影响

为了制定实验方案，我们选择了偶氮染料的浓度（图1）。在对照组中，培养12小时后，所有孢子均已萌发，并形成了长而未分枝的芽管。16小时后，观察到由活跃分枝的芽管组成的疏松菌落（絮状物）。施用偶氮染料4小时后，与对照组相比，菌丝顶端生长和菌丝体膨胀的形成均受到显著抑制。因此，我们选择了以下偶氮染料浓度：CR组为50 μg/mL，CFW组为75 μg/mL。值得注意的是，CR将菌丝体染成红色；与CFW处理的菌丝体相比，CR处理组菌丝体上出现大量球状菌丝顶端，且在菌落边缘未观察到菌丝顶端生长。相反，CFW处理组菌丝膨胀显著减少，且菌落边缘仅有微弱的菌丝顶端生长。同时，未观察到菌丝顶端裂解现象。

来源：MDPI

原文链接：https://www.mdpi.com/1422-0067/26/22/10888