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悬浮细胞培养摇瓶在昆虫细胞培养中的应用
发表日期:2021-06-04

细胞培养瓶是细胞培养中的一种耗材类产品,包括多种类型,其中悬浮细胞培养摇瓶是一种主要应用于悬浮细胞培养的耗材,尤其在昆虫细胞培养中应用比较多。

三角细胞培养摇瓶


悬浮细胞培养摇瓶


昆虫细胞是来自的一类,通过培养制造的病毒可作杀虫剂,基因片段可用来构建重组病毒以高效表达,生产某些药用蛋白。因此昆虫细胞的体外培养正逐渐成为生产用于和人类健康保健用的生物产品的重要手段。

利用悬浮细胞培养摇瓶培养昆虫细胞可按以下步骤操作:

1.  将4 ml 含10%胎牛血清的完全昆虫细胞培养基加入一个25 cm2 悬浮细胞培养摇瓶。取出一支冻存Sf9细胞的安瓿,迅速置于37℃水浴,用手前后剧烈摇动融化之,当安瓿的内容物几乎完全融化时,将安瓿浸入70%乙醇,消毒外壁。
2.  打碎安瓿颈部,将内容物转移至25 cm2 培养瓶,用手轻轻摇动培养瓶,使细胞分散均匀,于27℃温育2~3 h 直到细胞贴壁。

3.  除去旧培养液,换5 ml 含10%胎牛血清的新鲜完全培养液。继续温育,每3天换液一次,直到细胞生长汇片。
4.  准备一个新的25 cm2 培养瓶,加入4 ml 含10%胎牛血清的完全培养液

5.  当Sf9细胞已生长汇片时,弃去培养瓶中的培养液。加入新鲜的完全培养液,用移液管轻柔吹打或用手掌轻拍培养瓶,重悬细胞。
6.  用为培养组织细胞所设计的血细胞计数器计数细胞,在25 cm2 培养瓶中接种1×106~2×106个细胞,摇动培养瓶使细胞均匀分布。于27℃温育,每3天用含10%FBS的完全培养基换液,直到培养瓶中的细胞生长汇片。

高效摇瓶
高效摇瓶

7.  弃去汇片的单层培养细胞中的培养液,并重悬细胞。

8.  用血细胞计数器计数细胞。以约4×105~5×105细胞/ml 的密度将细胞接种于一个旋转培养瓶中。于27℃温育,以60~80 r/min 的速度恒速搅拌。轻微开启旁边的通气孔,以保证充足的空气。

9.  每隔2~3天进行细胞计数,当细胞密度达到2×106~2×106细胞/ml 时进行传代, 将适量细胞移至一个含有新鲜完全培养液的新培养瓶中,使终密度达到4×105~5×105细胞/ml。或者,倒出适当体枳的细胞悬液,代之以新鲜培养液。

10.  加入0.1 ml 的0.4%台盼蓝于1 ml 对数生长的细胞中,确定细胞活力。在低倍显微镜下检査细胞,计数被台盼蓝染色的细胞(死细胞),并计算总细胞数。

11.  将细胞传代至1份完全培养液/10%胎牛血请清和1份无血清培养液混合的液体中。让细胞长至汇片(单层培养),或达到2×106~3×106细胞/ml 的密度(悬浮培养)。

12.  将细胞传代至含胎牛血清完全培养液与无血清培养液比例为1:4的混合液中,让细胞生长。

13.  用完全培养液与无血清培养液比例为1:8至1:10的混合液,重复细胞传代与细胞生长的步骤。

14.  用无血清培养液传代细胞。

5层细胞工厂
5层细胞工厂

15.  计数呈指数生长的待冻存细胞,于室温以1 000g 离心10 min,弃去上清液。

16.  用含10%胎牛血清的完全培养液以1×107~2×107细胞/ml 的密度重悬细胞团块。 加入等体积含10%胎牛血清和20%DMSO的完全培养液,将细胞置于冰浴。吸出 1 ml 细胞移入带螺口盖的冻存管中,于-20℃保存2 h,然后于-70℃过夜。

17.  将冻结的细胞移至液氮罐中以便长期保存。

以上是悬浮细胞培养摇瓶在昆虫细胞培养中的应用,随着生物制药技术的不断发展,细胞培养瓶等耗材类产品的的市场需求量也将随之增加。

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