1.将PBS，胰酶置于37°C水浴锅中预热；

2.超净台中，吸去培养瓶中的培养液；

3.轻轻加入5mLPBS于细胞培养瓶中，轻轻晃动洗涤细胞后吸去PBS，共洗涤两次；

4.加入2mL浓度为0.05%的胰酶，轻轻晃动，使胰酶溶液均匀覆盖培养瓶底面。显微镜下，当70-80%的细胞变圆时轻拍培养瓶，并立即加入10mL人间充质干细胞无血清完全培养基进行中和。轻轻吸取瓶内液体反复冲洗瓶底，使细胞完全脱落；

注意：

1）吹打时动作要轻，避免损伤细胞；

2）建议使用浓度为0.05%的胰酶，并且消化时间不宜过长，以减少胰酶对干细胞的损伤。

5.将细胞悬液转移到15mL离心管中，300g离心10min；

6.小心去除上清，而后加入10mLPBS重悬细胞沉淀，并再次300g离心10min；

7.小心去除上清，加入2-3mL人间充质干细胞无血清完全培养基重悬细胞沉淀，按1：2或1：3的比例接种到新的细胞培养瓶中，再次加入足量的完全培养基，轻轻晃动培养瓶，使细胞分布均匀；

8.将细胞置于37°C，5% CO2的细胞培养箱中培养。