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MEF P0细胞培养基本方法
发表日期:2021-08-24

复苏:

  1. 将MEF P0细胞冻存管从液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁,防止污染。
  2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内,以1000 rpm,离心5 min。
  3. 离心后将上清液吸除,另加入新鲜的MEF完全培养液2 ml,吹打悬浮。
  4. 轻轻吹打,制成单细胞悬液,尽量避免气泡。
  5. 按照MEF细胞说明书上建议的复苏培养体系转移至1个T75培养瓶中培养,加入培养液14 ml。
  6. 放入37℃培养箱内培养。
  7. 复苏第二天观察,如死细胞较多,更换新鲜的MEF完全培养液,可以使细胞生长的更好。

MEF P0细胞培养基本方法

T175细胞培养瓶

传代:

  1. 待细胞长到90%-100%满时进行传代,一般3-4天,具体视细胞生长情况而定。
  2. 吸除废液。
  3. 用PBS(不含钙镁离子)轻轻冲洗一遍。
  4. 加入2.5 ml的0.25%胰酶(含EDTA)至培养瓶,轻轻晃动,使胰酶覆盖底面,置于37℃培养箱内消化细胞。
  5. 在显微镜下观察,直至细胞层全部脱落(一般需要1-2 min)。
  6. 加2.5 ml MEF完全培养液终止消化。
  7. 多次轻轻吹打细胞,制成单细胞悬液。
  8. 按照1:2-1:3的比例进行传代。
  9. 放入37℃培养箱内培养。

冻存:

  1. 按传代的方法将细胞消化下来,制成细胞悬液。
  2. 以1000 rpm,离心5 min,弃上清,逐滴加入已经预冷的冻存液,悬浮细胞。
  3. 按每支冻存管内加入500 ml细胞悬液分装到冻存管内,标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
  4. 将冻存管置于程序降温盒内,-80℃过夜,转入液氮。

冻存液配方: 
MEF完全培养液80%,FBS10%,DMSO 10%

MEF P0细胞培养基本方法

细胞工厂

丝裂霉素C处理:
  1. 一般地,P0代MEF细胞传至P3代时,可以进行丝裂霉素C(Sigma,M0503)处理。处理过后的MEF细胞不再增殖,可直接作为feeder使用。
  2. 传至P3代的MEF细胞长至80%以上时,吸出旧的MEF完全培养液,加入含丝裂霉素C(终浓度10 mg/ml )的新鲜MEF完全培养液(以T75培养瓶为例,加入培养液的体积为10ml )。37℃培养箱温育处理3小时。
  3. 吸出培养液,用PBS快速洗4遍以去除残余的丝裂霉素C。
  4. 消化细胞、细胞计数并冻存。一般地,一个T25培养瓶铺1´106细胞。


    细胞培养板

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