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细胞培养瓶在溶源性细菌检查中的应用
发表日期:2021-09-08


溶源性细菌是指染色体上整合有前噬菌体并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌,温和噬菌体已被广泛用于转导、基因工程载体和分子生命科学等领域。利用细胞培养瓶可对细菌进行溶源性检查,具体操作方法如下:

T225细胞培养瓶
T225细胞培养瓶

1.溶源菌培养:将经LB斜面活化的大肠杆菌225(λ),接种于装有20mlLB培养液的250ml细胞培养瓶内,30℃振荡培养16h,再从中取2ml菌悬液接入另装有20ml LB培养液的250ml三角瓶内,37℃振荡培养2h至对数期。

2.排除游离噬菌体:如待检菌株为芽孢杆菌,可先制成孢子悬液,再经80℃ 10min处理,杀死溶源菌表面可能吸附的及游离的噬菌体;如待检菌抹为非芽孢杆菌,可利用噬菌体制备的抗血清或0.2%柠檬酸钠溶液洗涤对数期溶源菌细胞,除去表面吸附的及游离的噬菌体。然后经4000r/min离心10min,上清液可加人敏感指示菌做双层平板测定,用于检验样品屮足孖钌游离的噬菌体及吸附「溶源菌表曲的噬菌体,离心后的菌体细胞进行诱导处理。

T175细胞培养瓶
T175细胞培养瓶

3.诱导溶源菌:离心后收集的菌体用无菌生理盐水洗涤两次,用生理盐水或100mmol/l Tris-HCL缓冲液(pH7.0)制成终浓度为1011个/ml细胞的菌悬液,每皿加5ml菌悬液,经紫外灯30W,距离30cm、照射30s,立即加入5ml双倍浓度的LB培养液,混匀后37℃黑暗中培养2h。

细胞工厂
细胞工厂

4.溶源性菌株检查:按双层琼脂法操作,取上述诱导裂解液加入几滴氯仿,以10倍稀释法适当稀释,选择后3个稀释度的稀释液,毎个稀释液取0.3ml与0.2ml对数期敏感大肠杆菌226菌悬液混匀,再加入融化后冷却至45℃的LB半体培养基,立即混匀,随即倾入LB固体培养基平板上,待凝固后,37℃培养6h观察。经过培养的平板如果有大量噬菌斑出现就证明被检菌株是溶源菌。

检查细菌是否具有溶源性可按照以上步骤进行操作,操作时注意过程中的无菌性,避免因操作不当影响检测结果。

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